Editácia génu je cielená modifikácia DNA na špecifickom mieste v genóme, ako je vymazanie, vloženie alebo nahradenie sekvencie.
Vo väčšine moderných pracovných postupov vykonávajú prácu tri mechanizmy:
- Zacielenie.Programovateľná molekula, zvyčajne vodiaca RNA, nasmeruje editačný enzým na zodpovedajúcu sekvenciu DNA.
- Strihanie alebo úprava.Nukleáza, ako je Cas9, vo všeobecnosti vytvára zlom v cieľovom mieste. Novšie nástroje (základné a hlavné editory) upravujú DNA bez úplného prerušenia dvojitého-reťazca.
- Oprava buniek.Bunka opravuje zmenu. Oprava náchylná k chybám (NHEJ) má tendenciu narušiť gén. Šablónou-riadená oprava (HDR) môže vložiť definovanú sekvenciu.
Tradičné metódy vs. úprava génov
| Faktor | Tradičné prístupy (šľachtenie, náhodná mutagenéza, klasická transgenika) | Programovateľná úprava génov |
| Presnosť | Nízka; zmeny sú často náhodné alebo ťažko lokalizovateľné | Vo všeobecnosti sa musia posúdiť vysoké, aj keď mimo{0}}cieľové účinky |
| Časová os | Mesiace až roky | Často týždne až mesiace, v závislosti od modelu |
| Dizajnérske úsilie | Premietanie-náročné | Dizajn-ťažký vpredu, menej premietania neskôr |
| Laboratórne požiadavky | Široký, všeobecný-účel | Má tendenciu potrebovať riadenú bunkovú-kultúru a molekulárne pracovné postupy |
| Regulačná pozornosť | Líši sa | Líši sa podľa jurisdikcie a aplikácie; inštitucionálne preskúmanie biologickej bezpečnosti je bežné |
Základné pravidlo pre rozhodnutia:
- Ak je vaším cieľom ašpecifické, definovanégenetická zmena, programovateľné úpravy sú vo všeobecnosti vhodnejšie.
- Ak potrebujete širokú, nezaujatú variáciu a môžete si dovoliť skríning, tradičná mutagenéza môže mať stále zmysel.
- Ak váš tím bude vykonávať úpravy častejšie ako príležitostne, naplánujte si miestnosť okolo pracovného postupu a neprispôsobujte ju neskôr.
Základné technické komponenty
Programovateľná nukleáza.Najbežnejšie sú enzýmy spojené s CRISPR- (varianty Cas9, Cas12). Na staršie nástroje, ako sú ZFN a TALEN, je zvyčajne ťažšie znova zacieliť-, pretože každý nový cieľ zvyčajne vyžaduje novo vytvorený proteín.
Vodiaca RNA (gRNA).Táto krátka RNA definuje, kde pôsobí editor. Kvalita dizajnu výrazne ovplyvňuje efektívnosť aj mimo{1}}cieľové riziko.
Oprava cesty a šablóny.Výsledok závisí od toho, ako bunka opraví zlom. Na presné vloženie je vo všeobecnosti potrebná šablóna darcu.
Spôsob doručenia.Možnosti zahŕňajú elektroporáciu, lipidové nanočastice, vírusové vektory a priame dodávanie ribonukleoproteínu (RNP). Voľba zvyčajne závisí od typu bunky, rozsahu a bezpečnostných požiadaviek. Formuje tiež priestor na lavici, manipuláciu s odpadom a potreby obmedzovania.
Ako sa to pripája k laboratórnym riešeniam BOKA
Samotná úprava génov je biologickým rozhodnutím. Či to funguje spoľahlivo, je čiastočne rozhodnutie o infraštruktúre. BOKA nedodáva editačné činidlá. Navrhujeme a budujeme laboratórne prostredie okolo pracovného toku.
Vo väčšine laboratórií úprav vyzerajú integračné body takto:
Laboratórne lavice.Chemicky -odolné,{1}}ľahko{2}}čistiteľné povrchy podporujú rutinnú bunkovú-kultúru a molekulárnu prácu. Rozloženia môžu oddeľovať kroky pred- a po-zosilňovaní, aby sa znížila krížová-kontaminácia.
Systémy vetrania a čistenia.Riadený prietok vzduchu a čistenie vzduchu pomáha udržiavať stabilné pracovné prostredie. Požiadavky závisia od vášho hodnotenia rizika.
Digestory.Potrebné, keď pracovné postupy zahŕňajú nebezpečné chemikálie, napríklad počas extrakcie alebo prípravy pufra.
Centrálne stanice a bočné stolíky.Tieto podporujú flexibilné, zdieľané pracovné priestory a zariadenia, ako sú odstredivky a tepelné cyklovače.
Stropné obslužné stĺpy askrine na plynové fľaše.Poskytujú organizovaný prístup k energetickým, dátovým a plynárenským službám (napríklad CO₂ pre inkubátory) s menším neporiadkom na úrovni lavice.
Biologické bezpečnostné skrinky, úrovne ochrany a certifikácie sa vo všeobecnosti riadia kontrolou biologickej bezpečnosti vašej inštitúcie. Vo fáze návrhu zvyčajne plánujeme usporiadanie miestnosti, inžinierske siete a prúdenie vzduchu podľa týchto požiadaviek.
Kde sa to hodí a kde nie
Vo všeobecnosti sa dobre hodí:
- Akademické alebo inštitucionálne výskumné laboratóriá vytvárajúce schopnosť úpravy organizmov-línií alebo modelov{1}
- Biotechnologické spoločnosti-zakladajú svoje prvé súpravy molekulárnej biológie a{1}}bunkovej kultúry
- Základné vybavenie, ktoré podporuje viacero projektov úprav so zdieľaným vybavením
- Vyučovacie laboratóriá predstavujúce techniky-genómového inžinierstva
- Existujúce laboratóriá rozširujúce sa o úpravy, ktoré potrebujú zónové rozloženie s lepším prúdením vzduchu a prístupom k pomôckam
Vo všeobecnosti nie je vhodné:
- Tímy hľadajúce reagencie na úpravu, enzýmy alebo služby syntézy. Tie BOKA nedodáva.
- Projekty, ktoré vyžadujú špecifickú certifikovanú úroveň ochrany bez dokončeného inštitucionálneho hodnotenia rizika. Toto hodnotenie zvyčajne musí byť na prvom mieste.
- Jedno{0}}jednorazové experimenty, ktoré môžu prebiehať prostredníctvom zmluvnej výskumnej organizácie, kde sa vyhradený priestor ťažko odôvodňuje.
FAQ
Je úprava génov rovnaká ako genetické inžinierstvo?
Nie presne. Genetické inžinierstvo je širší pojem. Úprava génov sa zvyčajne týka presných, cielených zmien na definovanom mieste.
Je CRISPR jedinou metódou-úpravy génov?
Nie. Existujú aj ZFN a TALEN. CRISPR má tendenciu byť preferovaný pre svoju flexibilitu a nižšie náklady na dizajn.
Potrebuje úprava génov špeciálne laboratórium?
Vo väčšine prípadov si vyžaduje riadenú bunkovú-kultúru a molekulárne pracovné postupy, a nie jeden konkrétny typ miestnosti. Požiadavky závisia od organizmu, vektorov a miestnych predpisov.
Môže BOKA pomôcť naplánovať laboratórium pre túto prácu?
Áno, pre usporiadanie, lavičky, vetranie, čistenie a inžinierske siete. Biologické protokoly a schválenie biologickej bezpečnosti zostáva vo vašej inštitúcii.
Plánujete laboratórium na-úpravu génov?Zdieľajte svoj pracovný postup a priestorové obmedzenia sBOKAtím. Pred začatím výstavby s vami môžeme prehodnotiť dispozičné riešenie, prúdenie vzduchu a úžitkové požiadavky.